IQ2000

在回答這個問題之前，必須要先知道樣品的保存方法是屬於哪一類。從冷凍保存的樣品中，可以很容易的回收較多的 DNA，而從酒精保存的樣品中，就相對比較困難。如果使用冷凍或新鮮的樣品，在萃取過程中磨碎蝦的組織時請不要磨的太用力，否則將會回收到太多的 DNA 與太多的蛋白質，特別是在使用 Lysis Buffer 的方法時。我們可由回收的 DNA沉澱的狀態得知是否有這個問題，如果是得到一個大且呈橘色的 DNA 沉澱物，且不易被水或是 TE buffer 溶解時，表示在萃取過程中磨碎蝦的組織時磨的太用力，正確的方式是只要將肌肉組織從蝦殼中擠出即可。

但是如果使用的是已被酒精固定的樣品，就必須磨的比較用力以獲得足夠的 DNA ，當酒精固定蝦的組織樣品時，蛋白質會被變性，使組織變得較硬，DNA 將會較難被釋放出來。與冷凍或新鮮的樣品相較之下，其 DNA 沉澱物較小，所以必須磨的比較用力並以比較少的 ddH₂O或 TE buffer 來溶解 DNA 沉澱。

已知眼球中含有 PCR 抑制物，當萃取種蝦的眼柄樣品時最好能夠移除眼球，或者使用DTAB/CTAB 的方式來萃取眼球與眼柄。因為 DTAB/CTAB 的方法可以有效的去除 PCR抑制物。但在萃取 PL 樣品時，不必在意這些微小動物的眼球。 肝胰腺也含有 PCR 抑制物，此外它也是消化器官，含有許多 DNase，樣品含有肝胰腺時，最好使用 DTAB/CTAB 的方式來萃取。

太多的 DNA 會降低擴增反應的效率，抑制 PCR 反應，有時並會導致電泳結果模糊的問題。我們建議將 DNA 濃度調整為每一反應在 200~1000 ng左右。

蝦樣品能夠保存在 -20℃ 的冰箱內，如果檢測對象是 DNA 病毒，如：WSSV，樣品在冰凍狀態且不曾解凍下，至少能保持一年。如果目標是 RNA 病毒，如：YHV，樣品即使保存在-20℃ 的冰箱中，保存期限也只有 2 到 3 個月。

樣品也能以95%酒精保存，這個方法只適用於 WSSV 和其他 DNA 病毒，RNA 病毒感染的樣品較不宜以酒精保存，因為靈敏度會降低 10 到 100 倍。

務必使用 GC 級的酒精來保存樣品，95% 藥用酒精或純酒精皆可，工業酒精的添加物會抑制 PCR 反應。酒精的體積至少需是樣品體積的兩倍，而且較大塊的組織必須切成小塊後再放入酒精內保存。

如果在採樣後 24 小時內就要萃取 DNA ，就可以利用 Lysis Buffer 或 DTAB 溶液保存樣品。保存在 Lysis Buffer 或 DTAB 溶液中的樣品放置於室溫下即可，絕對不要將被 Lysis Buffer 或 DTAB 溶液保存的樣品放置於冰箱中。

可以，用 TE buffer 溶解 DNA 沉澱比用 ddH₂O 好，如果想長期( 1 星期到 1 年)保存DNA 樣品，TEbuffer 是最好的，不過在例行的病毒檢測中，ddH₂O 比較方便，因為它不需要配製。

白點病毒可存在於許多蝦的組織中，當選擇採樣的目標組織時，要考慮三個因 素：1.含有較多的病毒，2.容易採樣，3.對蝦的傷害較小；因此選出腹(泳) 足、鰓、蝦血與胸足作為診斷的採樣目標。基本上因為腹足容易剪得且含有 較少的 PCR 抑制物，因此最常被選用。鰓是其次被推薦的病毒診斷採樣目標，因為對蝦比較不會造成太大的傷害，且可用來偵測許多其他病毒，如：IHHNV、YHV/GAV 和 TSV 等。

以 PCR 檢測種蝦最好的時機是在首次產卵後。首先，在產卵後檢測可以節省診斷費用，無法產卵的種蝦當然沒有檢測的必要，而產卵失敗的種蝦，多半已屬於嚴重感染。 其次，根據研究發現 PCR 陰性的卵與產卵後仍為 PCR 陰性的種蝦之間有相當高的關聯性，如果只選擇產卵後仍為PCR陰性的種蝦所產的卵，將能降低引入白點症病毒到種苗場的風險。已知一些造成壓力的因素如：天氣的改變、不良的水質，都能誘發白點症病毒的自我複製，而產卵對種蝦而言也是一種很大的壓力。如果種蝦在產卵後仍為 PCR 陰性，幾可確定這隻種蝦不帶有白點症病毒。

150 隻是大多數研究者所認同的數目。如果要在非常大(如：個體數超過 150,000 隻)的母群體中確認是否有被感染的個體，並且到達 95% 的信賴區間，在統計學上認為至少需採樣 150 隻。但不要將這 150 隻 PL一起萃取，因為大量的稀釋會產生偽陰性的結果；建議將這 150 隻 PL 分成 5 群，每群 30 隻且分別萃取 DNA 並分別跑 PCR。

有一些加壓篩選程序 (challenge procedures)，如採樣前以福馬林處理，被廣泛的應用在 PL 的採樣上。基本上，主要的概念是採樣時要選擇體型較小且較弱的動物。

關於養成池的檢測次數並沒有任何硬性規定，一般而言，建議每兩星期檢測一次。但是只要養成池內有任何不尋常的徵兆發生時，就是要檢測的時候。

建議的最小採樣數目是 5 隻，可以將這 5 隻蝦採集腹(泳)足後集中一起萃取 DNA 並一起跑 PCR。如果要採 10 隻蝦，最好分成 2 群分別檢測。和 PL 一樣，應選擇體型較小、較弱且靠近池邊的動物。

首先我們必須先定義"偵測極限 (detection limit)"，它的意義就是：只要最初的核酸模版(template) 數目高於偵測極限，PCR 系統就可不斷再現的偵測出陽性結果。就 IQ2000™WSSV的系統而言，它的偵測極限是每反應 10 隻病毒。

當病毒顆粒數目高於偵測極限，就能夠得到PCR陽性結果。如果反應的試管裡沒有任何病毒顆粒，結果當然是陰性。但當病毒數目低於偵測極限，如試管裡只有3隻病毒時，其結果就變成了統計議題，端視機率而定，亦結果有時是陽性但有時卻是陰性。

所以，PCR 陰性的意義是：這個特定的樣品不帶有病毒，或其病毒數目低於偵測極限。

首先，要求機器供應商每年定期調整熱循環加熱器的溫控，是屬於消費者的權利。然而，亦可從 IQ2000™ WSSV 系統中提供的 10-copy 標準品監控 PCR 效率，以了解熱循環加熱器是否正常的運作。假如 10-copy 標準品的實驗結果是形成 3 個亮帶 (910、550 和 296 bp)，表示熱循環加熱器靈敏度太高，這時第一次擴增反應需要減少 2 至 3 圈；反而言之，假如 10-copy標 準品沒有形成任何亮帶，第一次擴增反應就需要增加 2 至 3 圈，以提高靈敏度。

二次 PCR 的設計主要有兩項優點，首先，二次 PCR 能有效地提高靈敏度，就病毒診斷而言，靈敏度是非常重要的。其次，二次 PCR 能夠增加專一性，因為只有真正來自第一次PCR 的產物才能成為二次 PCR 反應的有效模版。

偽陰性的 PCR 檢驗結果多半肇因於 DNA 品質不良或 PCR 反應失敗，內部控制組(intenal control) 是預防這個問題最好的策略。就 IQ2000™ 系統而言，內控制組（又稱為宿主基因 house-keeping gene）是構成試劑的成分之一，使用者可以很容易的利用內部控制組來監控 DNA 品質和 PCR 程序。

偽陽性的 PCR 檢驗結果多半肇因於產物的污染，或在萃取 DNA 與加入反應試劑時的交互污染。要避免 PCR 產物污染後續實驗，最好是將執行電泳的空間與萃取樣品、配製試劑的空間區隔開來，並安排在相隔較遠的地方。而訓練好操作人員，使他們能夠正確的操作實驗，是避免交互污染問題的最佳方式。

藉由試劑內所附的定量陽性標準品即可監控系統的靈敏度，就 IQ2000™ 系統而言，可將陽性標準品以 yeast tRNA 稀釋至 10 copy/ul，並以此稀釋的標準品做為監控靈敏度的依據。假如 10-copy 標準品的實驗結果是形成 3 個亮帶( 910、550 和 296 bp)，表示靈敏度太高，這時第一次擴增反應需要減少 2 至 3 圈；反而言之，假如 10-copy 標準品沒有形成任何亮帶，第一次擴增反應就需要增加 2 至 3 圈，以提高靈敏度。

情況視所檢測檢體的種類而定，因為宿主基因是根據對蝦基因組而設計的，只有對蝦類的檢體才能形成正確大小的 PCR 產物。陰性對蝦類的檢體是一定要形成宿主基因的亮帶，來確認 DNA 品質，以避免誤判成偽陰性結果。至於其他甲殼類動物也可能會形成宿主基因的亮帶，但部分甲殼類動物的 PCR 產物大小會與對蝦有些許差異。如果是池土、池水或餌料等樣品，將不會形成宿主基因的亮帶。

可以檢測池水或池土，不過最好的方法是檢測存在於養殖環境周圍的潛在帶原動物，如在入水口附近或沈降池裡採集一些蝦（包括養殖和野生的種類）來檢測。此外，螃蟹是養殖環境中白點病風險的最佳指標，採集存在於養殖池周圍（甚至是在淡水中）的螃蟹，若檢測出任何中度或嚴重感染的帶原動物，都有將疾病傳染給養成池內健康的蝦的風險。

PCR 污染主要肇因於最終的 PCR 產物，或在萃取 DNA 與加入反應試劑時的交互污染。要避免 PCR 產物污染後續實驗，最好是將執行電泳的空間與萃取樣品、配製試劑的空間區隔開來，並安排在相隔較遠的地方。而訓練好操作人員，使他們能夠正確的操作實驗，是避免交互污染問題的最佳方式。